فحوصات الاليزا
نبذة مختصره
من الفحوصات المختبريه المصليه الشائعه و الذي يستعمل لقياس تركيز الماده التي في النيه الكشف عليها و هي اما اجسام مضاده او مستضد التي تكون موجوده في محلول. اساسيات فحص الأليزا يتميز او يختلف عن الفحوصات التي تعتمد على الاجسام المضاده بكونه يفصل بين التفاعل النوعي و غير النوعي و الذي يحدث نتيجه تفاعلات متسلسله على سطح صلب و الذي عادة يكون طبق متعدد الحفر من ماده البوليسترين، و هنالك امكانيه من تحديد كميه هذا التفاعل.
سلسله التفاعل في فحص الأليزا ينتج عنها في النهايه تكون مركب ملون شده هذا اللون لها علاقه بكميه الماده التي يتم الكشف عنها في ذلك المحلول ( المزيج).
فحص الأليزا سريع و بسيط و مصمم لفحص اعداد كبيره من النماذج في نفس الوقت ، وهو اختيار شائع الإستعمال لتقيم البحوث و لأغراض التشخيص
أسس فحص الأليزا
فحص الأليزا يبدأ بخطوه طلاء الطبقه الأولى في الطبق البلاستيكية و اما ان تكون المستضد او الأجسام المضاد ، إذ تلصق في قعر طبق البوليستيرين ألمتكون من (96) حفرها صغيره والذي يكون طبقه رقيق جدا بعد جفافه فوق السطح البلاستيكي الصلب . عمليه الطلاء يتبعها عمليه تفاعل المستضد أو الاجسام المناعي التي تم ربطها بالانزيم الذي يكشف عن وجوده في المعقد ألمتكون من تفاعل الاجسام المناعيه مع المستضد عندما يكون التفاعل موجبا و نوعيا و يتبعها خطوات الكشف عن نهايت هذا التفاعل بتكون اللون الذي يقدر شدته باستعمال جهاز قياس شده الضوء ( سبكتروفوتوميتر)
من الفحوصات المختبريه المصليه الشائعه و الذي يستعمل لقياس تركيز الماده التي في النيه الكشف عليها و هي اما اجسام مضاده او مستضد التي تكون موجوده في محلول. اساسيات فحص الأليزا يتميز او يختلف عن الفحوصات التي تعتمد على الاجسام المضاده بكونه يفصل بين التفاعل النوعي و غير النوعي و الذي يحدث نتيجه تفاعلات متسلسله على سطح صلب و الذي عادة يكون طبق متعدد الحفر من ماده البوليسترين، و هنالك امكانيه من تحديد كميه هذا التفاعل.
سلسله التفاعل في فحص الأليزا ينتج عنها في النهايه تكون مركب ملون شده هذا اللون لها علاقه بكميه الماده التي يتم الكشف عنها في ذلك المحلول ( المزيج).
فحص الأليزا سريع و بسيط و مصمم لفحص اعداد كبيره من النماذج في نفس الوقت ، وهو اختيار شائع الإستعمال لتقيم البحوث و لأغراض التشخيص
أسس فحص الأليزا
فحص الأليزا يبدأ بخطوه طلاء الطبقه الأولى في الطبق البلاستيكية و اما ان تكون المستضد او الأجسام المضاد ، إذ تلصق في قعر طبق البوليستيرين ألمتكون من (96) حفرها صغيره والذي يكون طبقه رقيق جدا بعد جفافه فوق السطح البلاستيكي الصلب . عمليه الطلاء يتبعها عمليه تفاعل المستضد أو الاجسام المناعي التي تم ربطها بالانزيم الذي يكشف عن وجوده في المعقد ألمتكون من تفاعل الاجسام المناعيه مع المستضد عندما يكون التفاعل موجبا و نوعيا و يتبعها خطوات الكشف عن نهايت هذا التفاعل بتكون اللون الذي يقدر شدته باستعمال جهاز قياس شده الضوء ( سبكتروفوتوميتر)
فحص الاليزا
كل فحوصات الاليزا تعتمد على التفاعل النوعي بين بؤره متكونه من سلسلة او مجسم ثلاثي الأبعاد من احماض امينيه متسلسله موجوده على المستضد و التي تنطبق مع المكان الموجود على الاجسام المضاده ألذي تتحد به. الاجسام المضادة التي تستعمل في فحص الاليزا قد تكون احاديه النسيله يمكنها الاتحاد مع بؤره واحده موجوده على المستضد بنوعيه او متعددة النسيله لها القابلية على الاتحاد مع بؤر متعددة موجوده على المستضد بنوعية
هنالك أربعة أنواع أساسية من فحص الاليزا مما توفر قدر من المرونة يمكن ان تضبط اعتمادا على توفر الاجسام المضادة، النتيجة المطلوبه او تعقيدالنماذج. من الممكن استعمال أجسام مناعية وحيده او متعددة النسيله. الاجسام متعددة النسيله تستعمل في فحص الاليزا غير المباشر و الاجسام المناعيه وحيدة النسيله تستعمل في فحص الاليزا الأولي المباشر للكشف عن المستضدات
فحص الاليزا المباشر
يستعمل في هذا الفحص اطباق متعددة الحفر مطليه بالمستضد يتم الكشف عنه بواسطه الاجسام المضاده المقترن بالانزيم. كذلك يمكن عكس التفاعل و ذلك بطلاء قعر الحفر بالاجسام المضاده و يستعمل مستضد مقترن بالانزيم للكشف و هذا النوع قليل الاستعمال. يعتبر فحص الاليزا المباشر سريع لكون خطواته قليله بالاضافه إلى كون الخطأ به قليل الحدوث
كل فحوصات الاليزا تعتمد على التفاعل النوعي بين بؤره متكونه من سلسلة او مجسم ثلاثي الأبعاد من احماض امينيه متسلسله موجوده على المستضد و التي تنطبق مع المكان الموجود على الاجسام المضاده ألذي تتحد به. الاجسام المضادة التي تستعمل في فحص الاليزا قد تكون احاديه النسيله يمكنها الاتحاد مع بؤره واحده موجوده على المستضد بنوعيه او متعددة النسيله لها القابلية على الاتحاد مع بؤر متعددة موجوده على المستضد بنوعية
هنالك أربعة أنواع أساسية من فحص الاليزا مما توفر قدر من المرونة يمكن ان تضبط اعتمادا على توفر الاجسام المضادة، النتيجة المطلوبه او تعقيدالنماذج. من الممكن استعمال أجسام مناعية وحيده او متعددة النسيله. الاجسام متعددة النسيله تستعمل في فحص الاليزا غير المباشر و الاجسام المناعيه وحيدة النسيله تستعمل في فحص الاليزا الأولي المباشر للكشف عن المستضدات
فحص الاليزا المباشر
يستعمل في هذا الفحص اطباق متعددة الحفر مطليه بالمستضد يتم الكشف عنه بواسطه الاجسام المضاده المقترن بالانزيم. كذلك يمكن عكس التفاعل و ذلك بطلاء قعر الحفر بالاجسام المضاده و يستعمل مستضد مقترن بالانزيم للكشف و هذا النوع قليل الاستعمال. يعتبر فحص الاليزا المباشر سريع لكون خطواته قليله بالاضافه إلى كون الخطأ به قليل الحدوث
فحص الاليزا غير المباشر
يطلى قعر الطبق بمستضد معرف و يتم الكشف عنه في مرحلتين او بطبقتين الأولى هي وضع اجسام مضاده غير مقترنه بأنزيم و هي نوعية للمستضد. بعدها يتبعها وضع اجسام مناعية مضاده مقترنه بالانزيم تتحد مع الاجسام المناعيه الأولى. الاجسام المضادة المقترنه بالانزيم عادة تكون ضد كلوبيولينات الحيوان الذي يتم الكشف عن الأجسام المضاد في مصله لذلك المستضد الموجود في قعر الحفره
محاسن فحص الاليزا غير المباشر
يزيد من حساسيه الفحص و ذلك لأتحاد اكثر من جسم مضاد مقترن بالأنزيم بالجسم المضاد الاولي المتحد بالمستضد
المرونه وذلك لامكانيه استعمال اجسام مناعيه أولية مختلفة للكشف عن المستضد باستعمال اجسام مضاده ثانوية واحده مقترنه بالانزيم موجه ضد كلوبيولينات نوع كاما للدجاج او لذلك الحيوان الذي جمعت منه الأمصال للكشف عن الاجسام المناعية ضد مستضد للعامل المرضي
التوفير بالكلفه و ذلك لاستعمال عدد قليل من الاجسام المضادة المقترنه بالانزيم
يطلى قعر الطبق بمستضد معرف و يتم الكشف عنه في مرحلتين او بطبقتين الأولى هي وضع اجسام مضاده غير مقترنه بأنزيم و هي نوعية للمستضد. بعدها يتبعها وضع اجسام مناعية مضاده مقترنه بالانزيم تتحد مع الاجسام المناعيه الأولى. الاجسام المضادة المقترنه بالانزيم عادة تكون ضد كلوبيولينات الحيوان الذي يتم الكشف عن الأجسام المضاد في مصله لذلك المستضد الموجود في قعر الحفره
محاسن فحص الاليزا غير المباشر
يزيد من حساسيه الفحص و ذلك لأتحاد اكثر من جسم مضاد مقترن بالأنزيم بالجسم المضاد الاولي المتحد بالمستضد
المرونه وذلك لامكانيه استعمال اجسام مناعيه أولية مختلفة للكشف عن المستضد باستعمال اجسام مضاده ثانوية واحده مقترنه بالانزيم موجه ضد كلوبيولينات نوع كاما للدجاج او لذلك الحيوان الذي جمعت منه الأمصال للكشف عن الاجسام المناعية ضد مستضد للعامل المرضي
التوفير بالكلفه و ذلك لاستعمال عدد قليل من الاجسام المضادة المقترنه بالانزيم
ألأليزا نوع الساندوش المباشر و غير المباشر
يحتاج فحص الاليزا نوع الساندوج إلى نوعين من الاجسام المناعية موجه ضد مستضد واحد و لاكنهما يتحدان في موقعين مختلفين في جزيئة المستضد بعيده عن بعضها لكي لا يتداخلا. الجسم المستضد الاول يدعى المسك وهو الذي يطلى فوق سطح حفر طبق البولي سترين بعد ذلك يضاف محلول المستضد وهو المستضد المراد معرفته (النموذج). بعد ذلك يضاف طبقة ثانيه من الأجسام المضادة تدعى الاجسام المضادة الكاشفة والتي تكون مقترنة بالانزيم و ذلك لقياس تركيز المستضد المراد الكشف عنه .إذ كان كانت الأجسام المناعية الكاشفة هي التي مقترنة بالانزيم ، فطريقه الاليزا تدعى طريقه الساندويج المباشره ، اما إذا كانت الأجسام المضادة الكاشفة هي غير مقترنة ، فتكون هنالك حاجه لاجسام مناعيه ثانيه مقترنه بالانزيم للكشف و هذه الطريقة تعدى طريقة ساندوج الاليزا غير المباشره
يحتاج فحص الاليزا نوع الساندوج إلى نوعين من الاجسام المناعية موجه ضد مستضد واحد و لاكنهما يتحدان في موقعين مختلفين في جزيئة المستضد بعيده عن بعضها لكي لا يتداخلا. الجسم المستضد الاول يدعى المسك وهو الذي يطلى فوق سطح حفر طبق البولي سترين بعد ذلك يضاف محلول المستضد وهو المستضد المراد معرفته (النموذج). بعد ذلك يضاف طبقة ثانيه من الأجسام المضادة تدعى الاجسام المضادة الكاشفة والتي تكون مقترنة بالانزيم و ذلك لقياس تركيز المستضد المراد الكشف عنه .إذ كان كانت الأجسام المناعية الكاشفة هي التي مقترنة بالانزيم ، فطريقه الاليزا تدعى طريقه الساندويج المباشره ، اما إذا كانت الأجسام المضادة الكاشفة هي غير مقترنة ، فتكون هنالك حاجه لاجسام مناعيه ثانيه مقترنه بالانزيم للكشف و هذه الطريقة تعدى طريقة ساندوج الاليزا غير المباشره
محاسن فحص الاليزا نوع الساندوج المباشره و غير المباشر
تكون ذات نوعية عالية، و وذلك لاستعمال نوعان من الأجسام المضادة للكشف عن المستضد
ملائمه لنماذج المعقدة، لكون المستضد لا يحتاج إلى تنقية قبل الكشف عنه
توفر المرونه و الحساسية، لأمكانية استعمال الطريقتين المباشره و غير المباشره
تكون ذات نوعية عالية، و وذلك لاستعمال نوعان من الأجسام المضادة للكشف عن المستضد
ملائمه لنماذج المعقدة، لكون المستضد لا يحتاج إلى تنقية قبل الكشف عنه
توفر المرونه و الحساسية، لأمكانية استعمال الطريقتين المباشره و غير المباشره
تحت الإعداد
فحص الاليزا التنافسي او التثبيطي
فحص الاليزا التنافسي او التثبيطي
يعتبر فحص الاليزا التثبيطي من أعقد أنواع الاليزا و يستعمل لقياس تركيز المستضد ( او الاجسام المضادة) في ألنموذج وذلك بملاحظة الاعاقه في حدوث أشاره متوقعة وهي تكون اللون بعد إضافة كاشف حدوث التفاعل الموجب. لهذا السبب يطلق عليه أيضا فحص الايزا التثبيطي . من الممكن ان تكون قاعدته على أي نوع من فحوصات الاليزا السابقة، مباشره او غير مباشره او ساندوج، لذلك فأنه يتمتع بمستوى عالي من المرونه. كثيرا ما يستعمل عندما يكون هنالك نوع واحد من الاجسام المضادة متوفر للمستضد الذي نهتم به او عندما تكون المادة المراد الكشف عنها صغيره على سبيل المثال مستضدات غير كاملة (الهبتين) و لا يمكن الكشف عنها بواسطة نوعين من الاجسام المناعية مختلفة.هذا الفحص مبين ادناه
في المثال أعلاه يضاف النموذج إلى حفرة الطبق المطلي قعرها بمستضد معروف. بعد خطوات الطلاء و الغلق و الغسيل، يضاف النموذج غير المعروف إلى الحفرة في الطبق، بعد ذلك خطوات الكشف إلى حد ما مشابه لفحوصات الأليزا الأخرى. إذا كان المستضد في ألنموذج مطابقا للمستضد الذي تم طلاءه في قعر الحفره ، فيحدث تنافس على الأجسام المضادة الكاشفة بين المستضد المطلي في قعر الحفرة و مستضد ألنموذج الطليق. بحالة وجود تركيز عالي من المستضد في ألنموذج فسقل اللون بشكل معنوي في الحفرة، و على العكس إذا كان تركيز المستضد قليل فسيكون هنالك تغير قليل جدا في اللون
الاختيارات المتوفرة في فحوصات الاليزا
فحص الاليزا يعتمد على فائدة إمكانية اقتران إنزيم لإنتاج علامه يمكن الكشف عليها و هي مرتبطة بشكل مباشر بإرتباط الأجسام المضادة مع المستضد. هنالك عدد قليل من الانزيمات المختلفة و المواد التي تعمل عليها بنوعية (سبستريت) التي تستعمل بشكل خاص في فحص الاليزا، و طرق تختلف قليلا في استخدام او إدخال الانزيم في خطوات الطريقة. الخطوة النهائية في الفحص تتم بقراءة الأطباق في جهاز قياس شده الضوء (السبيكتروميتر) او في قارئ أشعه للضوء فوق البنفسجية (فلوروميتر) اعتمادا على المادة التي تعمل عليها الانزيمات المستعمله في الاقتران
الفحص المباشر
في الفحص المباشر يتم إقران الاجسام المضاده مباشرة بأنزيم الالكالاين فوسفيتيز او الهورس رادش بير أوكسيديز و هما من الانزيمات الأكثر استعمالا لغرض الكشف عن تفاعل او اتحاد الاجسام المضادة مع المستضد و الذي يتم الكشف عنه بإضافة المادة التي تعمل عليها هذان الانزيمان ( السبستريت) و نتيجة لذلك يتكون لون يمكن قراءة شدته باستعمال جهاز السبيكتروفوتوميت
الفحص غير المباشر
في هذا النوع تربط الاجسام المضادة مع البايوتين ، يتبعها خطوه اقتران الستربتا فايدين بالانزيم. بالإضافة إلى ذلك، من الممكن استعمال اجسام مضاده اوليه غير مقترنه، يتبعها اجسام مضاده ثانويه مقترنه بالانزيم او بالبايوتين ( بايوتينيليتد). إذا كانت الاجسام المضاده الثانويه مقترته بالبايوتين( بايوتينيليتد)، فتكون هنالك حاجه لخطوه ثالثه للكشف. في هذه الحاله المعامله بالستربتا فايدين المقترنه بالانزيم يتبعها المعامله مع ماده كاشفه ملائمه ( سبستريت)
نتائج فحص الاليزا
تعطي نتائج فحص الاليزا ثلاثه معلومات مختلفه
1- نتائج كميه
يمكن مقارنه نتائج اللليزا إلى منحنى قياسي ( يعمل بإستعمال قرءآت لتخفيفات متتاليه من مستضد نقي و معروف) و ذلك لحساب تراكيز المستضد بدقه في النماذج المختلفه
2- نتائج نوعيه
كذلك يمكن ان يستعمل فحص الاليزا لتحقيق اجابه فيما إذا كانت النتائج موجبه او سالبه ( نعم او لا ) حول وجود مستضد محدد او عدم وجوده في النماذج المختلفه بالمقارنه بحفره السيطره(بلانك) التي لاتحتوي على المستضد او تحوي مستضد لا علاقه له بالمستضد الذي يتم البحث عنه
3- نتائج شبه كمي
يمكن ان تستعمل نتائج فحص الاليزا لمقارنه مستوى المستضد النسبي في النماذج المفحوصه، و ذلك لكون شدة اللون المتكون تختلف بإختلاف تركيز المستضد
نتائج فحص الاليزا بشكل مثالي ترسم على شكل خط بياني للكثافه الضوئيه مقابل لوغارثم التركيز لعمل منحنى على شكل حرف( أس) كما في الشكل أدناه
الفحص المباشر
في الفحص المباشر يتم إقران الاجسام المضاده مباشرة بأنزيم الالكالاين فوسفيتيز او الهورس رادش بير أوكسيديز و هما من الانزيمات الأكثر استعمالا لغرض الكشف عن تفاعل او اتحاد الاجسام المضادة مع المستضد و الذي يتم الكشف عنه بإضافة المادة التي تعمل عليها هذان الانزيمان ( السبستريت) و نتيجة لذلك يتكون لون يمكن قراءة شدته باستعمال جهاز السبيكتروفوتوميت
الفحص غير المباشر
في هذا النوع تربط الاجسام المضادة مع البايوتين ، يتبعها خطوه اقتران الستربتا فايدين بالانزيم. بالإضافة إلى ذلك، من الممكن استعمال اجسام مضاده اوليه غير مقترنه، يتبعها اجسام مضاده ثانويه مقترنه بالانزيم او بالبايوتين ( بايوتينيليتد). إذا كانت الاجسام المضاده الثانويه مقترته بالبايوتين( بايوتينيليتد)، فتكون هنالك حاجه لخطوه ثالثه للكشف. في هذه الحاله المعامله بالستربتا فايدين المقترنه بالانزيم يتبعها المعامله مع ماده كاشفه ملائمه ( سبستريت)
نتائج فحص الاليزا
تعطي نتائج فحص الاليزا ثلاثه معلومات مختلفه
1- نتائج كميه
يمكن مقارنه نتائج اللليزا إلى منحنى قياسي ( يعمل بإستعمال قرءآت لتخفيفات متتاليه من مستضد نقي و معروف) و ذلك لحساب تراكيز المستضد بدقه في النماذج المختلفه
2- نتائج نوعيه
كذلك يمكن ان يستعمل فحص الاليزا لتحقيق اجابه فيما إذا كانت النتائج موجبه او سالبه ( نعم او لا ) حول وجود مستضد محدد او عدم وجوده في النماذج المختلفه بالمقارنه بحفره السيطره(بلانك) التي لاتحتوي على المستضد او تحوي مستضد لا علاقه له بالمستضد الذي يتم البحث عنه
3- نتائج شبه كمي
يمكن ان تستعمل نتائج فحص الاليزا لمقارنه مستوى المستضد النسبي في النماذج المفحوصه، و ذلك لكون شدة اللون المتكون تختلف بإختلاف تركيز المستضد
نتائج فحص الاليزا بشكل مثالي ترسم على شكل خط بياني للكثافه الضوئيه مقابل لوغارثم التركيز لعمل منحنى على شكل حرف( أس) كما في الشكل أدناه
حساسية فحص الاليزا
يعتبر فحص الاليزا من الفحوصات الأكثر حساسيه المتوفرة. ويمكنه الكشف على تراكيز واطئة من المواد تتراوح بين 0.01-0.1 نانوغرام. كما ذكر سابقا فان فحص الاليزا غير المباشر ينتج عنه مستوى عالي من اللون و بذلك هو اكثر حساسية، مع ذلك قد يسبب مستوى عالي من التلوين الخلفي لذلك يقلل من مستوى التلون النوعي للتفاعل
مصدر المعلومات مأخوذ بتصرف من
An Introduction to ELISA
www.abdserotec.com/an-introduction-to-elisa.html
يعتبر فحص الاليزا من الفحوصات الأكثر حساسيه المتوفرة. ويمكنه الكشف على تراكيز واطئة من المواد تتراوح بين 0.01-0.1 نانوغرام. كما ذكر سابقا فان فحص الاليزا غير المباشر ينتج عنه مستوى عالي من اللون و بذلك هو اكثر حساسية، مع ذلك قد يسبب مستوى عالي من التلوين الخلفي لذلك يقلل من مستوى التلون النوعي للتفاعل
مصدر المعلومات مأخوذ بتصرف من
An Introduction to ELISA
www.abdserotec.com/an-introduction-to-elisa.html