طرق التشخيص الجزيئيه
طرق التشخيص الجزيئي
Molecular Identification Procedures
التشخيص الجزيئي للمسببات المرضيه التي تصيب الطيور يعتمد على كشف الاحماض النوويه ( ر ن أ) أو ( د ن أ) الخاص ( الفريد) لذلك المسبب المرضي. بالاضافه الى ذلك فان تحليل ترتيب ( تسلسل) الاحماض النوويه يستعمل لتحديد النمط و تحت النمط و النوع و تحت النوع و النمط المصلي و النوع المرضي و في بعض الاحيان العتر الفرديه للمسببات المرضيه. فحوصات التشخيص الجزيئي تعتمد على تقنيات مثل
Restriction fragment length polymorphism, Hybridization with nucleic acid probes, Polymerase chain reaction, Random amplified polymorphic DNA, and nucleic acid sequencing.
معرفة هذه التقنيات هو ضروري لفهم و تفسير نتائج فحوصات التشخيص الجزيئي التي تعتمد على هذه التقنيات.
المقدمه
ال (دي أن أي) يتكون من قواعد ( أدنين) و ( كوانين) و (سيستوسين) و (ثايامين) ،ترتيبها يكون الشفره الجينيه ، هذه القواعد مرتبطه ببعضها بواسطة سكر ( ديوكسي رايبوز) وسلسله من الفوسفات التي تكون التركيب المفرد لخيط ال(دي أن أي). الهايدروجين يربط بين القواعد(الارجنين يكون ثنائي مع الثايمين و الكوانين يكون ثنائي مع السايتوسين ) و تمسك خيطين من (دي أن أي) مع بعض.
كما هو الحال مع (دي أن أي) ، فان ال (آرأن أي) يحوي قواعد ، عدى كونه يحوي على اليوراسيل بدلا عن الثايامين. عادة ال (آرأن أي) يحوي على ضفيره واحده و هو غير ثابت مثل ال (دي أن أي). ال(آرأن أي) يحوي سلسله من الرايبوز و الفوسفات بينما ال(دي أن أي) يحوي على سكر الديوكسيرايبوز. ال(آرأن أي) المرسل يعمل كحامل للمعلومات الجينيه من ال ال(دي أن أي) لتركيب البروتينات.
الشفره الجينيه ، او تسلسل القواعد الفعلي للكائن الحي في المورثات و الجينات التي تحويها هي فريده لكل الكائنات الحيه ( الجينوم). لذلك ، فعندما تعرف او يٌتأكد من الشفره الوراثيه للمسبب ، فان هذه المعلومات يمكن ان تستعمل للتعرف (تشخيص) بشكل نوعي على المسببات المرضيه التي تصيب الدواجن و ذلك بالكشف عن وجود الشفره الوراثيه ( جينومها).
جمع النماذج و خزنها
ال(دي أن أي) و خاصة ال(آرأن أي) حساسه للتلف بشكل كبير لذلك يجب العنايه للحفاض على الاحماض النوويه عندما تجمع النماذج لعمل التشخيص الجزيئي. معظم النماذج المرضيه التي تجمع من الحالات المرضيه تحوي على عوامل معديه و من ضمنه انسجه و دم و مسحات من الجهاز التنفسي العلوي او من الامعاء و حتى عضام يمكن ان تستعمل في عملية إجراء التشخيص الجزيئي. النماذج الجديده (الطازجه) يجب ان تحفظ بارده او مجمده لمنع التحلل في النماذج مما يؤدي إلى تلف الاحماض النوويه بواسطة الانزيمات المحلله لل ( آر أن أي ) و (دي أن أي). بدلا عن تبريد او تجميد النماذج المرضيه ، يمكن ان تخلط مع الفينول ذو درجة حموضه (7.4) لل(دي أن أي) و درجة حموضه (4.5) لل(آرأن أي) و ذلك لإبطال الانزيمات المحلله للاحماض النوويه و الحفاض على الاحماض النوويه. الطريقه البسيطه لحفظ و نقل النماذج المرضيه لغرض التشخيص الجزيئي هو إستعمال بطاقات خاصه و هي عباره عن ورق ترشيح خاص يحوي ماده لابطال المسببات المرضيه و يحافظ على الاحماض النوويه. توضع النماذج المرضيه مباشرةً على هذا الورق الخاص و تترك لتجف. من السهوله نقل هذه الاورق الخاصه دون تبريد و باستعمال الرخصه الخاصه لنقل النماذج الحيويه. بعد ذلك يمكن عزل الاحماض النوويه من قطعه تأخذ من هذا الورق الخاص الحاوي على النموذج.
أسم الشركه المنتجه لهذا الورق الخاص هو
Finders Technology Associates (FTA) cards
Whatman, Middlesex, UK.
Molecular Identification Procedures
التشخيص الجزيئي للمسببات المرضيه التي تصيب الطيور يعتمد على كشف الاحماض النوويه ( ر ن أ) أو ( د ن أ) الخاص ( الفريد) لذلك المسبب المرضي. بالاضافه الى ذلك فان تحليل ترتيب ( تسلسل) الاحماض النوويه يستعمل لتحديد النمط و تحت النمط و النوع و تحت النوع و النمط المصلي و النوع المرضي و في بعض الاحيان العتر الفرديه للمسببات المرضيه. فحوصات التشخيص الجزيئي تعتمد على تقنيات مثل
Restriction fragment length polymorphism, Hybridization with nucleic acid probes, Polymerase chain reaction, Random amplified polymorphic DNA, and nucleic acid sequencing.
معرفة هذه التقنيات هو ضروري لفهم و تفسير نتائج فحوصات التشخيص الجزيئي التي تعتمد على هذه التقنيات.
المقدمه
ال (دي أن أي) يتكون من قواعد ( أدنين) و ( كوانين) و (سيستوسين) و (ثايامين) ،ترتيبها يكون الشفره الجينيه ، هذه القواعد مرتبطه ببعضها بواسطة سكر ( ديوكسي رايبوز) وسلسله من الفوسفات التي تكون التركيب المفرد لخيط ال(دي أن أي). الهايدروجين يربط بين القواعد(الارجنين يكون ثنائي مع الثايمين و الكوانين يكون ثنائي مع السايتوسين ) و تمسك خيطين من (دي أن أي) مع بعض.
كما هو الحال مع (دي أن أي) ، فان ال (آرأن أي) يحوي قواعد ، عدى كونه يحوي على اليوراسيل بدلا عن الثايامين. عادة ال (آرأن أي) يحوي على ضفيره واحده و هو غير ثابت مثل ال (دي أن أي). ال(آرأن أي) يحوي سلسله من الرايبوز و الفوسفات بينما ال(دي أن أي) يحوي على سكر الديوكسيرايبوز. ال(آرأن أي) المرسل يعمل كحامل للمعلومات الجينيه من ال ال(دي أن أي) لتركيب البروتينات.
الشفره الجينيه ، او تسلسل القواعد الفعلي للكائن الحي في المورثات و الجينات التي تحويها هي فريده لكل الكائنات الحيه ( الجينوم). لذلك ، فعندما تعرف او يٌتأكد من الشفره الوراثيه للمسبب ، فان هذه المعلومات يمكن ان تستعمل للتعرف (تشخيص) بشكل نوعي على المسببات المرضيه التي تصيب الدواجن و ذلك بالكشف عن وجود الشفره الوراثيه ( جينومها).
جمع النماذج و خزنها
ال(دي أن أي) و خاصة ال(آرأن أي) حساسه للتلف بشكل كبير لذلك يجب العنايه للحفاض على الاحماض النوويه عندما تجمع النماذج لعمل التشخيص الجزيئي. معظم النماذج المرضيه التي تجمع من الحالات المرضيه تحوي على عوامل معديه و من ضمنه انسجه و دم و مسحات من الجهاز التنفسي العلوي او من الامعاء و حتى عضام يمكن ان تستعمل في عملية إجراء التشخيص الجزيئي. النماذج الجديده (الطازجه) يجب ان تحفظ بارده او مجمده لمنع التحلل في النماذج مما يؤدي إلى تلف الاحماض النوويه بواسطة الانزيمات المحلله لل ( آر أن أي ) و (دي أن أي). بدلا عن تبريد او تجميد النماذج المرضيه ، يمكن ان تخلط مع الفينول ذو درجة حموضه (7.4) لل(دي أن أي) و درجة حموضه (4.5) لل(آرأن أي) و ذلك لإبطال الانزيمات المحلله للاحماض النوويه و الحفاض على الاحماض النوويه. الطريقه البسيطه لحفظ و نقل النماذج المرضيه لغرض التشخيص الجزيئي هو إستعمال بطاقات خاصه و هي عباره عن ورق ترشيح خاص يحوي ماده لابطال المسببات المرضيه و يحافظ على الاحماض النوويه. توضع النماذج المرضيه مباشرةً على هذا الورق الخاص و تترك لتجف. من السهوله نقل هذه الاورق الخاصه دون تبريد و باستعمال الرخصه الخاصه لنقل النماذج الحيويه. بعد ذلك يمكن عزل الاحماض النوويه من قطعه تأخذ من هذا الورق الخاص الحاوي على النموذج.
أسم الشركه المنتجه لهذا الورق الخاص هو
Finders Technology Associates (FTA) cards
Whatman, Middlesex, UK.
إستخلاص الحامض النووي و تنقيته
الاحماض الامينيه (دي أن أي) و ( آر أن أي) يمكن استخلاصها تقريبا من كل النماذج المختبريه. (دي أن أي) يستخلص بطرق مختلفه. واحده من ابسط الطرق لاستخلاص ال(دي أن أي) من الخلايا الكامله و الجراثيم بضمنها المايكوبلازما هي طريقة الغليان. بإختصار ، تكدس الخلايا بواسطة وضعها في جهاز الطرد المركزي ، بعد ذلك يعاد تعليقها بمحلول دارئ الترس ( إي دي تي أي) ذو درجه حموضه مقدارها (7.4) و يسخن الى درجة (100) مؤيه لمدة (10) دقائق لحل الخلايا. يمكن إستعمال الخلايا المنحله مباشرة في فحص ال(بي سي آر) او ال(دي أن أي) يمكن ان ينقى اكثر بواسطة الترسيب بإستعمال محلول أسيتات الصوديوم (0.3 أم) و درجه حموضه ( 5.2) تركيز نهائي و حجم مساوي من (100 %) كحول مثيلي . بعد الترسيب يعلق ال ال(دي أن أي) في محلول دارئي مناسب . هنالك عدة مستحضرات تجاريه جاهزه و من مصادر مختلفه لاستخلاص ال(دي أن أي) . معضم هذه المستحضرات تعتمد على إستعمل الفينول للاستخلاص ، يتبعها ترسيب الحامض النووي اوطريقة التحليل يتبعها ربط الاحماض النوويه مع السيليكات في انبوب زجاجي عمودي او في اغشيه . بعد الغسيل تحرر الاحماض النوويه من السيليكات بإستعمال الدارئ المناسب.
“ Some of the DNA extraction methods described for identification of avian
pathogen include QIAamp DNA extraction kit and DNAzol reagent.”
اكثر المحاليل انتشارا و المستعمله لاستخلاص ال( آر أن أي) من الخلايا و الانسجه و المسببات المرضيه هو
“ TRIzol is a phenol and guanidine isothiocyanate solution"
هذا المحلول يحفظ ال( آر أن أي) خلال عمليه تحلل الخلايا و العوامل المرضيه . يستخلص ال( آر أن أي) من المزيج بواسطة الكلوروفورم و ينقى بواسطة الترسيب بكحول الايسوبروبيل كما موصى من قبل الشركه المنتجه. في الآخر ، بعض المستحضرات توفر تنقية الحامضان النوويان ال(دي أن أي) و ال( آر أن أي) مثل
“ QIAamp MinElute kit”
“ Some of the DNA extraction methods described for identification of avian
pathogen include QIAamp DNA extraction kit and DNAzol reagent.”
اكثر المحاليل انتشارا و المستعمله لاستخلاص ال( آر أن أي) من الخلايا و الانسجه و المسببات المرضيه هو
“ TRIzol is a phenol and guanidine isothiocyanate solution"
هذا المحلول يحفظ ال( آر أن أي) خلال عمليه تحلل الخلايا و العوامل المرضيه . يستخلص ال( آر أن أي) من المزيج بواسطة الكلوروفورم و ينقى بواسطة الترسيب بكحول الايسوبروبيل كما موصى من قبل الشركه المنتجه. في الآخر ، بعض المستحضرات توفر تنقية الحامضان النوويان ال(دي أن أي) و ال( آر أن أي) مثل
“ QIAamp MinElute kit”
تفاعل البوليميريز المتسلسل
Polymerase Chain Reaction (PCR)
واحد من اهم التطورات المعنويه في علم الاحياء الجزيئيه ، وهو الاساس في عدد كبير من الفحوصات التشخيصيه للمسبب المرضيه لامراض الدواجن هو تفاعل البولي ميريز المتسلسل. يمكن القول ببساطه ان تفاعل البولي ميريز المتسلسل يضخم ( يكثر) كميه قليله جدا من ال(دي أن أي) الى كميه يمكن الكشف عليها. التفاعل يستعمل ( تي أي كيو) بوليميريز ، و هي (دي أن أي) بوليميريز، لا تتلف في الحراره العاليه ، . . لإكثار الماده الوراثيه ( الجينوم) للمسببات المرضيه. ال( دي أن أي) بوليميريز هي الانزيم الذي يكون خيط جديد من ال( دي أن أي). من المهم انها تبقى فعاله في في درجات الحراره العاليه و ذلك يعود الى ان الخطوه الاولى في تفاعل البوليميريز المتسلسل هو رفع درجة الحراره التفاعل الى (95) درجه مؤيه. بشكل مثالي هنالك ثلثة خطوات في تفاعل البوليميريز المتسلسل ، تُكرر( 30-40 ) مره . هذه الخطوات هي تغير الحاله الطبيعيه على درجة حراره ( 95) درجه ، تكون البرايمات على درجة حراره (37-56) مؤيه و من ثم اتحاد القطع المتكونه ( بلمره) على درجة حراره (72) درجه مؤيه
Steps of PCR
1- Denaturation at (95º C) 2- Primer hybridization 3- Polymerization at (72ºC).
يبرمج الجهاز الذي يغير بين درجات الحرارات الثلاثه بشكل متكرر بواسطة الكومبيوتر مما يجعل هذا التغير ذاتي (أوتوماتكي) في فحص تفاعل البوليميريز المتسلسل.
بشكل عام فإن ال( دي أن أي) الذي في النيه اكثاره يحاط بزوج من القطع القصيره من ال(دي أن أي) يطلق عليها ( البرايمرات) وهي معموله صناعياً و التي تكون نوعيه ( متطابقه) لقالب ال(دي أن أي ) المراد تكثيره. ال(دي أن أي ) المراد إكثاره تغير حالته الطبيعيه بمعاملته بالحراره ، و يسمح للبرايمرات للتزاوج (هايبرادايز) لل(دي أن أي ) بواسطة خفظ حراره المزيج. عندما تتم خطوةاتحاد القطع المتكونه ، تتم استنساخ السلسله الموجوده بين البرايمرات ، منتجةً كميه مقدارها مرتين من ال(دي أن أي ) الذي كان موجوداً في النموذج . بواسطة تكرار الخطوات الثلاثه
(a) Denaturation ( b) Hybridisation ( c) Polymerization
عدة مرات ، يتم الحصول على كميه كبيره من ال(دي أن أي ) . عندما يستعمل انزيم الترانسكربتيزالمعاكس (ريفيرس) و التي تُكون ال(دي أن أي ) من قالب ال(آرأن أي ) في الخطوه الاولى من التفاعل فان جميع مصادر ال(آرأن أي ) يمكن ان تكثر باستعمال فحص تفاعل البوليميريز المتسلسل.
مصادر ال(آر أن أي) التي يمكن استعمالها في الفحص
(Messenger RNA, Ribosomal RNA ,Genomic RNA)
الفحوصات التي تستعمل فحص تفاعل البوليميريز المتسلسل لاكثار الحامض النووي للمسببات المرضيه الموجوده باعداد قليله ، تزيد حساسيه الفحص .بعد ذلك فان ال( دي أن أي) الذي تم إكثاره يمكن تحليله بدقه بواسطة الفحوصات الخاصه بالاحماض النوويه
تفاعل البوليميريز المتسلسل الآني
Real Time PCR
يعتمد هذا الفحص على وجود (سبيكتروفوتوميتر) لقياس التغير في لون المزيج الموجود في جهاز تغير الحراره المتسلسل ( ثيرموسايكلر) . شدة اللون لها علاقه في مقدار إكثار ناتج تفاعل البوليميريز المتسلسل خلال فتره الفحص. تضاف صبغه مشعه الى المزيج لها قابليه الاتحاد مع ال(دي أن أي) المتكون ، و تقاس شده الضوء المتكون في نهاية كل دوره من تفاعل البوليميريز المتسلسل و بذلك يمكن الكشف عن الناتج (دي أن أي) الذي تم اكثاره في هذا التفاعل في وقت حدوثه الحقيقي. هنالك عدة طرق للكشف و متابعة تكون اللون المشع اكثرها انتشارا هي
SYBR green , TaqMan® probes , and fluorescence resonance energy transfer (FRET)
صبغة سايبر الاخضر هي ماده تشع عندما تتفاعل مع ال(دي أن أي) في المزيج . خلال كل دوره من فحص تفاعل البوليميريز المتسلسل يتكون (دي أن أي) جديد و يتحد مع هذه الصبغه . لذلك فكلما تزيد كمية ال(دي أن أي) تزيد كميه الاستشعاع. تؤخذ قرءآت الاستشعاع في نهاية كل دوره من فحص تفاعل البوليميريز المتسلسل. الكواشف الاخرى (بروبس) تعتمد على أقتران ال(دي أن أي) بماده مشعه تتحد بشكل خاص مع قطعة ال(دي أن أي) المستهدفه التي يتم إكثارها.
المعلومات التي يتم الحصول عليها في فحص تفاعل البوليميريز المتسلسل الآني ترسم كوحدات إستشعاع لكل دوره من تفاعل البوليميريز المتسلسل الآني. توضع قيمه نهائيه للاستشعاع يحدد على اساسها كون النموذج موجب و عدد الدورات التي يحتاجها النموذج لكي يعبر هذه القيمه تسمى درجة الدوره.
“Real time PCR data generally plotted as florescence units per PCR cycle number. A threshold value of fluorescence is set to indicate when the sample is considered positive and the number of cycles needed for a sample to cross the threshold is reported as the cycle threshold or CT.”
إختلاف اطوال قطع ال(دي أن أي) بواسطة الانزيمات المحدده
Restriction fragment length polymorphism (RFLP)
Restriction fragment length polymorphism (RFLP)
هذه التقنيه تستعمل خمائر(إنزينات) محدده لمعرفة فيما اذا كانت قطعتين من ال(دي أن أي) متشابهتان. الخمائر المحدده تقطع ال(دي أن أي) الثنائي في سلسله محدد ه (مكان) تسمى مكان التعرف. يقطع ال(دي أن أي) بواسطة انزيم محدد و السلسله المتكونه ( اوالخيط) يفصل بواسطة طريقة الترحيل الكهربائي إعتماداً على حجمها. إذا لم تكن حجوم خيوط ال(دي أن أي) متشابه ، فان ترتيب الحزم على هلام الاكار لا يتطابق و يمكن الاستنتاج ان تسلسل خيوط ال(دي أن أي) مختلفه في مكان التعرف ( القطع). أما اذا كان ترتيب الحزم يتطابق فان التسلسل يعتبر متشابه ولكن نحتاج الى إجراء فحص آخر لتحديد فيما أذا كانت قطعتى ال(دي أن أي) متطابقه لان الانزيمات المحدِده تميز فقط سلاسل قصيره نسبياً من التراكيب الاساسيه للاحماض النوويه ( النيوكليوتيدات).
ال(دي أن أي) الوراثي (الجينوم) المعزول من عامل مرضي غير معروف يمكن ان يستعمل للتعرف على جرثومه محدده او مايكوبلازما او فايرس وذلك بمقارنة شكل الحزم المتكونه على الهلام بشكل الحزم المتكونه لقطع قياسيه معروف ( مصدر معروف). إذا كان المسبب المرضي المراد تشخيصه يحوي على (آر أن أي) وراثي (جينوم) ، وهي الحاله مع عدة فايروسات ، فإن ال(أر أن أي) يمكن ان يحول الى (دي أن أي) باستعمال تقنية الاستنساخ المعاكس . عندما تتبع هذه العمليه بتضخيم (الاكثار) ال(دي أن أي) بواسطة سلسلة تفاعل البوليميريز ، فسيتكون (دي أن أي) كافي للحصول على معلومات كافيه من عمل فحص الانزيمات المحدده عليه. هذه التقنيه يطلق عليها
(RT/PCR-RFLP). Converting the RNA to DNA using the technique of reverse transcriptase (RT)
في بعض حالات التعرف على المسببات المرضيه ، من الممكن النظر فقط على وجود او عدم وجود الموقع او المواقع التي يتعرف عليه الانزيم المحدد. الطريقه تعمل بالضبط كما تم شرحه سابقاً عدى ان حجم قطع المتكونه من ال(دي أن أي) غير مهم.النتيجه تكون موجبه اذا قطع ال(دي أن أي) في أي موقع. لذلك فان اي تقليل في حجم ال(دي أن أي) الاصلي هو دليل على وجود مكان ميزته او عملت عليه الانزيمات المحدده. تجرى هذا الطريقه عادة على قطع قصيره من ال(دي أن أي) التي تكونت باستعمال طريقة
RT/PCR and has been commonly called RT/PCR-RE.
ال(دي أن أي) الوراثي (الجينوم) المعزول من عامل مرضي غير معروف يمكن ان يستعمل للتعرف على جرثومه محدده او مايكوبلازما او فايرس وذلك بمقارنة شكل الحزم المتكونه على الهلام بشكل الحزم المتكونه لقطع قياسيه معروف ( مصدر معروف). إذا كان المسبب المرضي المراد تشخيصه يحوي على (آر أن أي) وراثي (جينوم) ، وهي الحاله مع عدة فايروسات ، فإن ال(أر أن أي) يمكن ان يحول الى (دي أن أي) باستعمال تقنية الاستنساخ المعاكس . عندما تتبع هذه العمليه بتضخيم (الاكثار) ال(دي أن أي) بواسطة سلسلة تفاعل البوليميريز ، فسيتكون (دي أن أي) كافي للحصول على معلومات كافيه من عمل فحص الانزيمات المحدده عليه. هذه التقنيه يطلق عليها
(RT/PCR-RFLP). Converting the RNA to DNA using the technique of reverse transcriptase (RT)
في بعض حالات التعرف على المسببات المرضيه ، من الممكن النظر فقط على وجود او عدم وجود الموقع او المواقع التي يتعرف عليه الانزيم المحدد. الطريقه تعمل بالضبط كما تم شرحه سابقاً عدى ان حجم قطع المتكونه من ال(دي أن أي) غير مهم.النتيجه تكون موجبه اذا قطع ال(دي أن أي) في أي موقع. لذلك فان اي تقليل في حجم ال(دي أن أي) الاصلي هو دليل على وجود مكان ميزته او عملت عليه الانزيمات المحدده. تجرى هذا الطريقه عادة على قطع قصيره من ال(دي أن أي) التي تكونت باستعمال طريقة
RT/PCR and has been commonly called RT/PCR-RE.
المصدر
A LABORATORY MANUAL FOR THE ISOLATION , AND IDENTIFICATION OF AVIAN PATHOGENS. Published by THE AMERICAN ASSOCIATION OF AVIAN PATOLOGIST.(2008)
A LABORATORY MANUAL FOR THE ISOLATION , AND IDENTIFICATION OF AVIAN PATHOGENS. Published by THE AMERICAN ASSOCIATION OF AVIAN PATOLOGIST.(2008)